국내 연구진이 DNA를 잘라 교정하는 유전자가위*의 정확성을 높일 수 있는 방법을 개발했다. 향후 유전자가위를 이용한 유전자 및 줄기세포 치료의 부작용을 줄이는데 크게 기여할 것으로 기대된다.
    * 유전자가위(engineered nuclease) : 특정 염기서열을 인식해 절단하거나 교정하도록 고안된 인공제한효소로 유전자변이 유도 또는 유전자 수선에 사용

서울대학교 김진수 교수와 조승우, 김소정 학생이 주도한 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 리더연구자지원사업(창의적연구)의 지원으로 수행되었고 유전체 분야 국제학술지 지놈 리서치(Genome Research) 온라인판 11월 20일자에 게재되었다.
( 논문명 : Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-endonucleases and nickases)

RNA 유전자가위*는 유전자를 교정하는데 사용될 수 있지만 원하는 DNA 염기서열 이외 유사한 서열에서도 작용한다는 문제가 있었다.
    * RNA 유전자가위(RNA-guided engineered nuclease, RGEN) : 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR 시스템을 이용해 연구자가 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 인공제한효소로 인간 및 동식물 유전자 교정에 사용되는 제3세대 유전자가위.

연구팀은 유사 DNA 염기서열에는 작용하지 않고 표적 DNA 염기서열만을 선택적으로 잘라 교정하는 유전자가위 기술을 개발했다. 

의도하지 않은 DNA 염기서열을 자르게 되면 세포독성을 일으키거나 원하지 않는 염색체 변이를 유발할 수 있어 유전자가위의 정확성은 유전자가위의 임상적 응용을 위한 핵심과제로 꼽힌다.

이 기술은 유전학 연구, 유전자 및 줄기세포 치료제 개발, 유전자 교정을 통한 고부가가치 농축산물 품종 개량 등에 널리 활용할 수 있어 관련 연구에 활기를 불어넣을 것으로 기대된다. 

정확성 향상의 핵심은 가이드 RNA*의 구조와 전달형태에 있다.
    * 가이드 RNA(guide RNA) : RNA 유전자가위의 DNA 특이성을 결정하는 작은 RNA 분자. 가이드 RNA는 Cas9이라는 단백질과 결합하여 RNA 유전자가위를 형성한다. 가이드 RNA만 교체하면 손쉽게 새로운 RNA 유전자가위를 만들 수 있어 생명과학 여러 분야에서 널리 사용되고 있다. 

가이드 RNA 앞에 두개의 구아닌* 염기를 추가한 경우 표적 염기서열에 대해서는 잘 작용하면서도 유사서열에는 작용하지 못하게 되어 절단의 정확성을 높인 것이다.(사진설명 참조)
     * 구아닌 : 당과 인산과 함께 유전물질을 구성하는 성분인 염기(아데닌, 티아민, 구아닌, 시토신) 가운데 하나. 탄소와 질소 원자로 이뤄진 2개의 고리구조를 갖는다. 

한편 연구팀은 제1세대 유전자가위인 징크핑거뉴클리아제(ZFN)를 비롯, 제2세대 탈렌(TALEN), 제3세대 RNA 유전자가위를 개발한데 이어 RNA 유전자가위의 정확성을 높인 것으로 주목받고 있다.  

김 교수는 “이번 연구는 RNA 유전자가위의 정확도를 높임으로써 의도치 않은 돌연변이를 막고 유전자를 정교하게 교정할 수 있는 방법을 제시하였다”고 연구의의를 밝혔다.

RNA-guided Endonuclease(RGEN) 기술은 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 새로운 유전자 가위 기술로서, 원하는 DNA 서열에 Double Strand Break (DSB) 를 일으킬 수 있도록 유도하고, 유도된 DSB의 repair 과정을 통해 표적자리에 변이 또는 재배열을 일으킬 수 있는 기술이다.

이전의 연구를 통해 인간 배양 세포에서 RGEN 기술을 이용한 유전자 편집이 가능하다는 것이 알려진 이후 여러 동물 및 식물에서 RGEN 기술을 이용해 높은 효율로 간편하게 유전체 편집이 가능함이 밝혀졌고, 앞으로 유전공학 뿐만 아니라 바이오산업 및 의학 등의 분야에서 널리 이용될 것으로 각광받고 있다.

유전자 가위를 세포에 도입할 때, 원하지 않는 DNA를 무작위로 자르게 되면 독성을 일으키거나 여러 가지 염색체 변이를 유발할 수 있기 때문에 선택적으로 표적 DNA만을 자르는 것이 매우 중요하다. RGEN의 경우, 빈번하게 표적자리 외의 DNA를 자를 수도 있다는 사실이 보고되어 다양한 분야에 응용하는데 있어 걸림돌이 되고 있다.

연구팀은 RGEN 기술을 적용하는데 있어, 표적자리의 염기서열선택과 guide RNA의 구조에 따라 표적 선택성을 크게 높일 수 있으며, 이를 통해 선택적으로 표적자리에만 돌연변이를 유도하면서 비특이적 변이를 일으키지 않는 방법을 제시하였다.

지난 연구에서 RGEN을 세포에 도입했을 때, 세포에서 표적자리와 유사한 일부 염기서열에서 비특이적인 변이가 관찰 되지 않음을 보고하였다. 하지만 최근 논란이 되고 있는 RGEN의 부작용을 심층적으로 연구하기 위해 11가지의 RGEN을 만들어 인간배양세포에 도입하였고, 보다 적은 비율로 존재하는 돌연변이까지도 관측할 수 있도록 0.1% 이하의 변이를 관측할 수 있는 deep sequencing 방법을 적용하였다.

11개의 RGEN의 경우 표적자리에서 최대 75% 의 매우 높은 효율로 돌연변이가 유도 되었다. 하지만 유전체 내에서 표적자리와 유사한 수백개의 염기 서열에서 돌연변이를 분석한 결과, 표적 염기 서열과 비교해 1개의 염기 서열이 다른 경우에만 비특이적인 돌연변이가 빈번하게 관찰되었다. 

또한 이 중 2가지의 RGEN을 인간 배양 세포에 처리하여 변이가 일어난 단일 세포 클론을 얻은 뒤 exome-sequencing을 수행하여 표적자리 이외의 어떤 곳에서도 돌연변이가 발견되지 않는다는 것을 관찰하였다. 이러한 연구를 통해 유전체 내에서 표적자리를 선택에 따라 부작용이 거의 없는 유전자 가위를 만들 수 있다는 사실을 보고하였다.

또한 비특이적인 돌연변이를 유도하는 것으로 이미 보고된 RGEN에 대한 실험을 수행하여 이러한 활성을 줄일 수 있는 방법을 알아보았다. 그 결과 guide RNA의 구조와 전달형태에 따라 표적자리에 대한 효율은 변함없으나 특이성을 높일 수 있다는 사실을 밝혀냈다.

RGEN을 적용에서 무분별한 돌연변이는 최소화하고 표적자리에 유전자를 정교하게 교정할 수 있는 방법을 제시하였다. 다양한 응용 연구 및 질병 치료에 적용하여 바이오 연구 및 산업에 기여 할 수 있을 것으로 기대한다.

연 구 결 과 문 답

가이드 RNA의 구조를 변경하여 보다 정교하게 작용하는 RNA 유전자가위를 제작하였다.

유전자 녹아웃을 통한 유전학 연구, 유전자 및 줄기세포 치료제 개발, 유전자 교정을 통한 고부가가치 가축, 농작물 생산 등 생명과학과 생명공학 및 분자의학의 모든 분야에서 활용될 수 있다.

분자생물학, 유전학 연구에는 이미 널리 활용되고 있고 가축, 농작물 개량도 활발히 연구되고 있으나 정부의 인허가 과정이 아직 불확실하다. 치료제 개발 가능성도 매우 높으나 이 역시 정부의 인허가 과정이 가장 큰 영향을 미치게 된다.

CRISPR는 미생물이 바이러스를 억제하기 위해 가지고 있는 일종의 면역체계이다. 우리는 이를 인간배양세포와 동물에 최초로 도입해 유전자 교정의 도구로 활용하는데 성공하였다.

CRISPR 시스템을 이용한 유전자 교정 방법은 지난 1월 본 연구진 포함해서 미국의 5 개 연구진이 최초로 보고 하였다.

지난 수개월 동안 여러 연구실에 의해 CRISPR 시스템을 이용한 RNA 유전자가위가 목표 유전자 이외에도 수많은 표적외 장소에 작용한다는 연구결과가 보고되었다. 반면 우리 실험결과에 의하면 RNA 유전자가위가 매우 정교하게 작용하였다. 리뷰어들의 요청으로 그 원인을 밝힌 다음에야 논문이 게재승인 되었다.

목표라기보다 희망을 말하자면 올해 말 Science의 Breakthrough of the Year, Nature Methods의 Method of the Year로 CRISPR 유전자가위 기술이 선정되기를 기대한다. 

논문을 발표하기 위해 과학을 하지 말고 세상을 변화시키기 위해 과학을 하기 바랍니다. 논문은 과학을 하는 과정에서 나오는 부산물이지 목표가 될 수 없습니다.

그림. 절단 특이성이 향상되면 세포에 RGEN 유전자 가위를 도입했을 때, 부작용이 발견되지 않는 돌연변이 세포를 쉽게 얻을 수 있으며, 향후 유전자 치료 등에 적용하기에 적합하다.                            
(왼쪽) 기존 RGEN의 특이성
비특이적인 돌연변이를 일으키는 RGEN의 경우, 표적 염기서열과 비교해 많게는 5개 염기서열이 다른 유사 염기서열에서도 DNA 절단을 일으킬 수 있다.
(오른쪽) 개선된 RGEN의 특이성
guide RNA에  표적염기 서열과 상관없는 다른 염기가 추가된 경우 2개의 염기 서열만 다른 경우에도 효과적으로 절단하지 못하는 것으로 밝혀졌다. 

 

 

출처 : 생명과학 미래창조과학부 (2013-11-21 10:38)