국내 연구진이 염기서열 8개로 구성된 핵산 앱타머*를 개발했다. 차세대 분자인식물질**로 주목받는 DNA 앱타머의 길이는 줄이고표적과의 결합력은 높여 축산가공품이나 물 등에 잔류할 수 있는 테트라사이클린 계열 항생제를 검출할 수 있는 센서 등 다양한 바이오센서 개발에 기여할 것으로 기대된다.
  * 앱타머 : 특정 타겟물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 핵산(DNA 또는 RNA)
 ** 분자인식물질 : 단백질, 아미노산 같은 생체고분자나 환경호르몬, 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 바이러스 및 박테리아 등 다양한 표적물질을 인식하도록 개발된 물질로 단백질 항체와 앱타머 등이 있다. 

고려대학교 생명과학대학 구만복 교수 연구팀이 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 중견연구자지원사업(핵심)의 지원으로 수행한 이번 연구결과는 생명화학분야 국제학술지 케미컬 커뮤니케이션즈지 11월 26일 온라인판에 게재되었다. 향후 표지논문으로 최종 출판될 예정이다.
 ( 논문명 : An Ultra-sensitive Colorimetric Detection of Tetracyclines using the Shortest Aptamer with Highly Enhanced Affinity ）

앱타머는 기존 항체 등의 분자인식 물질보다 열안정성이 우수하며 생체외 합성이 가능하다는 점에서 주목받고 있다.  하지만 통상 염기서열 70개 이상으로 구성된 DNA 앱타머의 길이 때문에 표적물질에 대한 민감도가 떨어지고 생산단가가 높아진다는 한계가 있었다.

연구팀은 테트라사이클린 계열 항생제를 특이적으로 인식하는 염기서열 8개의 가장 작은 앱타머를 개발했다. 결합에 불필요한 서열을 제거하고 결합성능을 극대화할 수 있는 최적의 서열을 도출한 데 따른 것이다. 

길이를 10배 가까이 줄인 것으로 향후 약물개발, 약물전달시스템, 바이오센서, 정제시스템 등에 쓰이는 분자인식물질로 개발될 경우 비용절감과 성능향상에 기여할 것으로 기대된다.  구체적으로 옥시테트라사이클린에만 결합하는 염기서열 76개로 구성된 앱타머 5종의 염기서열을 분석하여 공통적으로 발견되는 염기서열을 추출하는 한편 불필요한 서열을 제거해 앱타머의 길이를 최소화했다. 

앱타머와 표적항생제가 결합하면 금나노입자가 뭉치면서 원래의 빨간색이 보라색으로 바뀌는 것을 통해 이같은 특이적인 결합을 확인했다.  개발된 앱타머와 표적물질과의 결합을 신호로 바꿔 줄 수 있는 적절한 플랫폼을 개발하는 것이 향후 과제이다. 

구 교수는 “염기서열 76개로 구성된 앱타머 서열 중 실제 결합에 관여하는 핵심서열을 찾아 앱타머 바이오센서의 민감도를 높인 것”이라고 밝혔다.

1. 연구배경

앱타머는 양 끝에 있는 증폭과정에 필요한 PCR primer(약 염기서열 36개) 사이에 불특정 염기서열(random region) 30~40개 정도가 존재한다. 그리고 앱타머의 특이성을 결정짓는 부분이 이들 불특정 염기서열 부분에 있을 것으로 추정하고 있다. 이에 앱타머를 연구하는 과학자들은 전체적으로는 특이성을 결정짓는 염기서열만을 찾아내는데 관심을 가지고 있다. 왜냐하면 앱타머와 타겟간의 실제 상호작용에서 참여하지 않는 서열을 제거함으로써 앱타머의 affinity를 향상시킬 수 있고 앱타머를 활용한 앱타머 바이오센서의 민감도 또한 향상될 수 있을 뿐만 아니라, 앱타머와 타겟 분자간의 상호작용을 밝혀주는 메커니즘 규명 연구를 구체적으로 진행할 수 있기 때문이다. 이러한 목표를 달성하기 위하여 앱타머 길이를 조절하여 앱타머와 타겟간 실제 상호작용을 하는 염기서열을 찾고자 하는 엔지니어링 truncation 연구가 활발히 진행 중에 있다.

2. 연구내용

본 연구진은 앱타머 truncation의 연구를 진행하기 위하여 옥시테트라사이클린에만 결합하는 것으로 나타나는 염기서열 76개로 구성된 앱타머 5종에 대하여 일차적으로  불특정 염기서열(random region)에 대하여 분석하였다.

분석결과 이들 불특정 염기서열내에 보존된 부분이 발견되었고 이들을 중심으로독창적인 추정과 엔지니어링 방법을 통하여 세상에서 가장 작은 앱타머 크기인 염기서열 8개로 구성된 앱타머 후보를 2개 truncation하여 개발하였다.
이들 염기서열 8개로 구성된 앱타머 2종에 대하여 금나노입자 색도분석 방법과 등온열량적정분석 방법을 통해 세상에서 가장 작은 앱타머가 특이하게도 테트라사이클린 그룹 전체에 특이성이 있으면서 매우 큰 친화도가 있다는 것을 밝혔다.

특히, 이들 염기서열 8개로 구성된 앱타머와 타겟간의 실제 결합 상호작용 메커니즘을 알아보기 위하여 3개의 테트라 사이클린계열 타겟(테트라사이클린, 옥시테트라사이틀린, 독시사이클린)에 대하여 Molecular Dynamics 시뮬레이션을 실시하였다. 그 결과 모든 테트라사이클린 그룹의 분자들이 모두 동일한  메커니즘으로 염기서열 8개의 앱타머와 결합하는 것을 알게 되었다.

모델링 결과를 토대로 염기서열 8개의 앱타머에 대한 추가적인 mutation 연구를 통하여 독창적인 방법으로 추정, 개발된 이들 앱타머 염기서열 만이 타겟 특이성이 있다는 것을 확인 하였고 이들 결과는 모델링 데이터 결과와도 정확하게 일치하였다.
 
3. 기대효과

세계에서 가장 작은 염기서열 8개로 구성된 앱타머는 그 생산단가가 매우 저렴하다.  실제로 대다수의 앱타머가 염기서열 76개 이상이라고 볼 때, 약 10배정도 비용절감 효과를 볼 수 있다. 이는 앱타머 바이오센서의 실용화에 가장 중요하다고도 볼 수 있는 생산단가 절감에 큰 기여를 하는 바, 실용화에 대한 기대가 크다.

이번에 개발된 염기서열 8개로 구성된 앱타머는 모든 테트라사이클린계열 항생제 4가지에 대하여 특이성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 하나의 앱타머가 테트라사이클린 그룹의 모든 항생제와 결합하기 때문에 테트라사이클린 계열 항생제 검출 바이오센서에 적용시, 하나의 바이오센서로 모든 타겟을 검출할 수 있는 이점이 있다.

본 연구의 핵심은 소위 앱타머 엔지니어링을 하는 truncation 방법론을 개발했다는 것이다. 단순히 가장 작은 앱타머를 우연히 발견한 것이 아니고 기존 앱타머의 독창적 분석을 통하여 truncation에 성공한 것이기 때문에, 특정 조건만 갖춰진 앱타머들이 개발된다면 동일한 방법론을 적용, truncation을 할 수 있을 것으로 전망되어 truncation을 통한 이점을 잘 살릴 수 있을 것으로 사료된다.

본 앱타머 엔지니어링 연구의 성공을 통하여 앱타머와 저분자물질 간의 상호작용 메커니즘 규명할 수 있었다. 현재 저분자 물질에 대한 앱타머가 보고되고 있지만, 저분자 물질에 비해 앱타머의 크기가 매우 크기 때문에 특정 염기서열만이 실제 상호작용에 관여할 것이라는 추정만이 있었고 염기서열이 상대적으로 작은 경우만이 밝혀져 있는 상황이다. 이번 앱타머 truncation연구를 통하여 앱타머-저분자물질간의 상호작용을 메카니즘을 규명함으로써 앱타머와 저분자물질간의 결합 메커니즘에 대한 이해를 한층 끌어올릴 수 있었다.  특히 이번에 밝혀진 결합 메카니즘은 이전에 보고되던 결합 메카니즘과는 상당히 다른 방식으로 결합하는 것을 보여주는 결과이다.

기존 앱타머의 길이를 획기적으로 줄인 작은 앱타머를 개발하여 민감도를 높이는 한편 생산비용을 절감시킴.

테트라사이클린 계열 항생제를 검출하는 앱타머 바이오센서에 쓰일 수 있음.

실용화 할 수 있는 여러가지 앱타머 바이오센서 플랫폼의 개발과정에 따라 달라질 것으로 예상. 이번에 분석용으로 사용된 금나노입자 플랫폼의 경우는 상당히 단축될 수 있음.

가장 작은 앱타머와 표적과의 결합을 신호로 바꿔 줄 수 있는 적절한 앱타머 바이오센서 플랫폼을 개발하는 것이 가장 중요한 과제임.

앱타머의 염기서열 분석과정 중 특정 서열이 보존되는 현상에 기반하여 독창적인 앱타머 엔지니어링 기법을 개발하기 위해 연구를 시작함.

저분자물질 뿐만 아니라 바이러스, 단백질 등의 타겟에 특이적인 앱타머에도 본 연구진의 독창적인 엔지니어링 기법을 적용, 짧은 앱타머를 성공적으로 개발 하는것.

실험 데이터를 분석하는 과정에서 당연 할 것으로 생각되는 사소한 데이터도 놓치지 말고 세심하게 분석할 것!

그림 1. 앱타머의 모식도
옥시테트라사이클린에 특이적인 5개의 앱타머(No.2, 4, 5, 20, 14)의 불특정 서열 부분에서 특정 서열이 앱타머 5개 모두에서 보존되는 사실을 기반으로 특정서열 부분을 중심으로 염기서열 8개로 구성된 앱타머를 개발하였음.

그림 2. Chem. Comm. 표지에 사용된 가장 작은 앱타머의 개념도

Journal reference
Chem Commun (Camb). 2014 Jan 4;50(1):40-2. doi: 10.1039/c3cc47108j. Epub 2013 Nov 1.
An ultra-sensitive colorimetric detection of tetracyclines using the shortest aptamer with highly enhanced affinity.
Kwon YS, Ahmad Raston NH, Gu MB.

출처 : 생명과학 미래창조과학부 (2013-11-28 09:59)