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공생균의 감염밀도 유지에 필요한 인자 규명

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  • 2013.10.15 18:42
공생균의 감염밀도 유지에 필요한 인자 규명...부산대 약대 이복률 교수팀
 
공생균*이 곤충의 장에서 적정밀도를 유지하는 비밀을 국내 연구진이 밝혀냈다. 향후 인체에 서식하는 1,000여종에 이르는 공생균에 대한 이해는 물론 친환경적인 농작물 해충방제에도 기여할 것으로 기대된다.
 * 공생균(共生菌) :  숙주에 해를 끼치는 세균과 달리 숙주에 좋은 영향을 주거나 아무런 영향을 미치지 않고 숙주 체내에 같이 사는 균

부산대 약대 이복률 교수팀이 수행한 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 글로벌연구실사업(GRL)의 지원을 받아 일본 산업기술종합연구소(AIST) 후카츠 박사팀과의 국제 공동연구로 수행되었다. 이 연구결과는 네이처 자매지인 The ISME(International Society for Microbial Ecology) 온라인판 10월 3일자에 게재되었다.
     (논문명 : Purine biosynthesis-deficient Burkholderia mutants are incapable of symbiotic accommodation in the stinkbug ) 

공생균은 숙주(宿主)가 얻지 못하는 영양분을 만들어 내거나 적으로부터 방어, 생식능력 조절, 숙주의 체력 및 면역력을 높이는 등의 영향을 끼칠 수도 있다. 

따라서, 장내 공생균의 밀도가 숙주의 여러 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있어 공생균의 증식을 조절하는 분자적 기전에 대한 연구가 필요했다.   

연구팀은 공생균이 곤충의 장에서 적정밀도를 유지하며 증식하는데 퓨린* 생합성에 관여하는 유전자 purL**이 필요함을 알아냈다. 

이 유전자가 고장난 돌연변이 공생균은 장에 도달하긴 하지만, 퓨린 생합성이 제대로 이뤄지지 못해 증식하기 어려워 정상 공생균에 비해 장내 감염밀도가 현저히 떨어졌다. 

특히, 숙주인 곤충의 성장에도 영향을 미치는 것으로 나타난다. 돌연변이 공생균을 가진 곤충은 장 발달이 늦고, 길이나 무게 등 성장속도도 느린 것으로 나타났다.
 * 퓨린(purine) : 육각형 고리를 가지는 방향성 유기 화합물 퓨린은 핵산의 기본골격 물질로 퓨린 생합성 과정이 진행되면 만들어지는 핵산의 단위체인 AMP 와 GMP 등이 DNA, RNA 합성과 에너지, 신호전달 물질로 쓰인다.
      ** purL : 퓨린 생합성에 필요한 효소 중 하나인 PurL (N-formylglycinamidine ribonucleotide synthase)의 유전자이다.

본 연구에는 지난 2년간 연구팀이 구축한 톱다리 개미허리 노린재*와 그 장에 서식하는 공생균 벅홀데리아의 공생모델 시스템이 이용됐다.
 * 톱다리 개미허리 노린재 : 콩이나 벼 등의 즙액을 빨아먹는 곤충으로 그 장에는 공생균으로 시험관 배양이 비교적 쉬운 벅홀데리아만 살고 있어 숙주-공생균의 분자적 기작을 이해하는데 좋은 모델시스템으로 인정받고 있다.  

유전체 여기저기를 옮겨 다니며 유전자에 무작위로 끼어드는 전이인자(transposon)를 이용해 1,800여개의 돌연변이 균을 만들고, 이 가운데 노린재와 공생관계를 이루지 못하는 균을 찾아낸 것이다. 

이 교수는“곤충의 장 공생인자가 인간의 장 공생균과 무관하지 않아 인체에 대한 연구에도 적용할 수 있을 것”이라며,“톱다리 개미허리 노린재는 농작물에 피해를 입히는 해충이기도 해 공생균을 이용한 환경친화적인 해충조절방법 개발에도 기여할 수 있을 것”이라고 밝혔다.

연 구 결 과  개 요
1. 연구배경
대부분의 척추동물 및 무척추동물은 숙주에 서식하는 공생균을 가지고 있으며 이들을 통해 숙주가 얻지 못하는 영양분을 얻거나 높은 효율의 번식과 숙주의 크기발달 그리고 숙주의 면역체계가 증진되는 사실이 보고되어 있다. 특히 곤충의 공생균은 그들이 숙주에 어떠한 영향을 주는지에 대해  많은 연구가 이루어 졌다. 하지만 그에 반해 곤충과 공생균 사이의 분자적 메커니즘에 대한 연구는 많이 이루어지지 않았는데, 그 이유는 곤충의 공생균은 배양에 어려움이 있기 때문이다.
최근 AIST 연구진에 의해 톱다리 개미허리 노린재(Riptortus pedestris)와  공생균 Burkholderia의 공생관계가 알려졌다. 이 공생균은 단일 종으로 노린재의 특정한 장에 서식하고, 쉽게 배지에 배양이 가능하다는 장점이 있다. AIST팀과의 공동연구로 본 실험실에서는 공생균이 있는 곤충과 공생균이 없는 곤충을 다량으로 생산하고, Burkholderia를 유전자 조작방법을 확립하였다. 이렇게 구축된 시스템으로 본 연구진은 장 공생균과 숙주와의 관계를 분자적 측면에서 연구하고 있다. 
2. 연구내용
공생을 이루지 못하는 Burkholderia의 mutant를 찾기위해 1,860개의 transposon mutants를 만들어 그들의 공생가능 여부를 확인한 결과, 하나의 mutant에 감염된 곤충에서 덜 발달한 장의 모습을 관찰하였다. PCR결과로 장이 덜 발달이 되었어도 그 속에 공생균은 존재함을 확인하고CFU 결과로 그 공생균의 수가 현저히 떨어진다는 것을 알게 되었다. 이 mutant는 purL이라는 purin biosynthesis에 관련된 유전자에 돌연변이가 생긴 것으로 밝혀졌다.
이 purL mutant의 감염기작을 자세히 알아보기 위해 초기 감염도를 살펴보았다. 감염 후 24시간 경과후 CFU를 한 결과, 107 cells/ml를 곤충에게 먹이면 약 30%의 감염도를 보였고 이것은 80% wildtype균 감염도보다 낮은 정도이다. 공생균의 밀도도 약 100배가 차이가 났다. 하지만 높은 농도의 균을 감염시키면 그 감염도나 밀도가 회복되는 것이 관찰되었다.
이러한 초기 감염도나 밀도가 곤충 장의 발달에 미치는 영향을 보기 위해 곤충 장의 발달을 그 두께로 측정하였다. 그 결과 purL이 감염된 곤충은 wildtype이 감염된 장과 감염이 되지 않은 장의 중간정도의 발달이 나타나는 것이 보였다. Confocal fluorescence microscopy로 장의 crypt의 발달을 24시간과 48시간에서 관찰하니 purL이 감염된 장의 crypt은 발달이 더뎠고 그것은 아마도 낮은 감염 밀도 때문인 것으로 추정된다.
purL 감염밀도가 곤충이 성장하면서 어떻게 되는지 알기위해 3, 4, 5령의 곤충의 장의 모습과 공생균의 CFU를 측정하였다. purL이 감염된 장의 모습은 그 크기는 wildtype이 감염된 장과 비슷하였으나 그 색은 훨씬 연한 반투명의 색을 띄었다. 색에 비례하여 purL 감염밀도는 거의 5-8배나 적은 것이 확인되었다. 3, 4, 5령의 곤충의 길이와 무게를 비교한 결과, purL을 감염시킨 곤충에서는 wildtype을 감염시킨 곤충보다 낮은 치수를 보였다. 이 결과는 purL mutant의 낮은 감염밀도가 장의 발달 뿐만 아니라 곤충의 fitness에도 영향을 미친다는 것을 보여준다.
    
3. 기대효과
본 연구에서 사용한 공생균의 유전자 조작법은 앞으로 많은 공생인자를 밝히는데 이용될 것이다. 이러한 유전학적으로 변형된 Burkholderia를 이용하여 콩과식물의 해충인 R. pedestris의 집단을 제어하는 기술로 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 R. pedestris 와 Burkholderia 공생 모델을 이용하여 인간의 장내 공생균에 대한 이해가 증진될 것으로 기대된다.

연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
Transposon mutagenesis라는 분자생물학적 방법을 통해 새로운 공생인자를 체계적으로 찾아내었다는 점.
어디에 쓸 수 있나
공생균을 이용한 해충퇴치를 위한 기반기술로 활용기대
실용화까지 필요한 시간은
앞으로 4-5년의 시간이 더 필요할 것 같음
실용화를 위한 과제는
톱다리 개미허리 노린재의 장에 선택적으로 작용하는 새로운 독신의 screening 및 그 in vivo 작용 규명 연구
연구를 시작한 계기는
장내 공생균이 숙주의 성장 발달에 많은 영향을 주는 사실을 이용하여 분자 수준에서 공생균과 숙주의 상호 작용을 규명하는 연구에 관심이 있었기에 본 연구를 시작하였음.
꼭 이루고 싶은 목표는
공생균과 숙주의 상호 작용을 분자 수준에서 규명하여, 이를 이용하여 새로운 친환경적인 방제제 개발에 활용가능한 원천 기반 기술을 도출함을 목표로 함.
신진연구자를 위한 한마디
개개의 젊은 연구자들은 국외 연구진과 경쟁이 되는 새로운 연구에 매진하여, 국가의 산업 발전에 도움이 되는 원천 기술을 도출하겠다는 꿈을 가지고 연구에 임하는 자세 필요.
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그림 1. 전이유전자 통한 공생돌연변이 발굴
전이유전자(Tn5)를 이용하여 만든 돌연변이균에 감염된 곤충은 wildtype 균이 감염된 곤충과 다른 장의 모습을 보인다. 이 돌연변이는 Tn5로 인해 purL이라는 유전자에 돌연변이가 생겼다. 
Wildtype Burkholderia(A)와 transposon mutant(B)에 감염된 곤충의 장의 모습. (C) 장에서 Burkholderia 16s rRNA가 있는지 알아보기 위한 PCR. (D) 장을 배지에 도포에 콜로니의 수를 세어 비교함. (E) Transposon이 purL 유전자에 삽입됨.
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그림 2. Wildtype과 purL 돌연변이공생균의 초기 감염도와 밀도
감염 후 24시간째 곤충의 장을 분석한 결과, purL 돌연변이 균은 감염도가 30% 정도이고, 감염밀도도 정상적인 균 (wildtype)에 비해 1000배 정도 낮았다.
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그림 3. purL 뮤턴트가 숙주 장에 미치는 영향
Wildtype가 감염된 곤충과 purL 돌연변이 균이 감염이 된 곤충은 장의 발달에서 차이가 보인다. 균이 감염되지 않은 곤충도 같이 비교하였다.
(A) 장의 두께 비교. WT,은 wildtype 균, purL은 purL균이 감염된 곤충, apo는 감염되지 않은 곤충. (B-G) 곤충의 장을 confocal microscopy로 관찰. 초록색은 핵을, 빨간색은 actin을 염색한 것임.
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그림 4. 감염 중기, 후기의 purL 돌연변이 공생균의 감염밀도
purL 돌연변이 공생균의 감염밀도는 곤충이 성장해도 계속 낮은 상태를 유지한다.
(A-F) 3령, 4령, 5령의 장의 모양비교. WT,은 wildtype 균, purL은 purL균이 감염된 곤충. (G) 3령, 4령, 5령의 장에 서식하는 공생균의 수.
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그림 5. purL 돌연변이 공생균이 숙주 체력에 미치는 영향
purL 돌연변이 공생균과 공생을 이루는 곤충은 길이와 무게에서도 wildtype균에 감염된 곤충보다 낮은 수준을 보인다.
(A) 3령, 4령, 5령의 곤충의 길이 비교. (G) 3령, 4령, 5령의 곤충의 무게 비교.
 
출처 : 생명과학 미래창조과학부 (2013-10-15 13:18)
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