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종양억제 단백질 활성 조절기전 규명

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  • 2013.10.30 09:05
국내 연구진이 대표적 종양억제 단백질 PTEN*의 새로운 조절인자를 찾아냈다. 이 조절인자를 표적으로 삼아 종양억제 활성을 높이는 방식의 항암제 개발연구도 추진하고 있는 만큼 종양억제 단백질을 재활성화 시키는 방식의 항암제 개발에 기여할 것으로 기대된다. 

* PTEN : 뇌, 유방, 전립선 등에 발생하는 암에서 처음으로 해당 유전자의 돌연  변이가 확인된 종양억제 단백질로 이러한 종양억제 기능은 이 단백질의 인산  제거활성(phosphatase)에서 기인하는 것으로 알려짐. 세포의 성장이나 전이에  관여하는 핵심 단백질(PIP3, Phosphatidyl inositol 3,4,5 tri-phsphphate)에 결합해  있는 인산기(phosphate group)를 떼어내어 이 단백질의 활성을 억제하는 종양억제   단백질로 p53이나 PML 같은 단백질의 조절을 받는 것으로 알려져 있다.
서울 아산병원/울산대학교 의과대학 김태원 교수와 진동훈 교수가 주도하고 홍승우, 문재희 박사 등이 참여한 이번 연구는 교육부(장관 서남수)와 한국연구재단(이사장 직무대행 김병국)이 추진하는 일반연구자지원사업(기본연구-기본연구) 등의 지원을 받아 수행되었고, 연구결과는 네이처 자매지 Cell death and differentiation 온라인판 10월 18일자에 게재되었다.
    (논문명 : p34 is a novel regulator of the oncogenic behavior of NEDD4-1 and PTEN)

NEDD4-1이라는 단백질이 PTEN에 여러 개의 유비퀴틴*을 결합시키면 이것이 마치 분해를 위한 꼬리표 역할을 해 원래의 종양억제 기능을 잃는다고 알려져 있다.
  * 유비퀴틴 : 76개 아미노산으로 구성된 단백질로 다른 단백질과 결합해 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 

하지만 상반된 연구결과도 있어 이들 두 단백질간의 상호관계를 밝히는 것이 관건이었다. 연구팀은 PTEN의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있는 NEDD4-1에 결합하는 단백질을 찾는 방식으로 PTEN의 또 다른 조절자(p34SEI-1)를찾아냈다. 

PTEN에 여러 개의 유비퀴틴을 결합시키는 과정을 촉진해 분해를 유도함으로써 종양억제 단백질을 무력화시키는 단백질을 찾아낸 것이다.  따라서 이 단백질을 억제할 수 있는 화합물 등이 PTEN을 재활성화 시킬 수 있는 새로운 항암제 후보물질이 될 것으로 기대된다. 나아가 연구팀은 이 단백질이 NEDD4-1 단백질의 안정화를 도와 PTEN의 종양억제를 방해하는 구체적인 기전까지 밝혀냈다.

인간 대장암, 전립선암 세포주와 환자조직 샘플에서도 NEDD4-1와 p34SEI-1가 동시에 발현되는 경우 PTEN의 발현이 낮은 것으로 나타났다. 연구팀은 “PTEN의 정확한 분해조절 기전을 밝혔고, 조절인자인 p34SEI-1을 발굴하고 작용기전을 규명했다는 데 의의가 있다”면서 “이 조절인자를 억제하는 약물이 개발되면 항암제로 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 현재 조절인자를 억제하는 약물을 개발 중에 있다”고 밝혔다.

연 구 결 과 개 요
1. 연구배경
 PTEN 단백질은 세포의 성장, 전이 등을 촉진하는 PI3K-Akt 신호 경로에 대한 길항 인자로 작용하는 종양억제 단백질로 잘 알려져 있다. 최근에 PTEN 단백질을 유비퀴틴화 시켜서 단백질 분해를 촉매하는 NEDD4-1이라는  E3 ubiquitin ligase가 동정되었으며 NEDD4-1 단백질이 PTEN 폴리유비퀴틴화를 촉진하여 단백질을 분해시켜 발암 유전자로서 기능을 한다는 것이 보고되었다. 또한, NEDD4-1은 PTEN의 폴리유비퀴틴화 뿐만 아니라 모노유비퀴틴화도 촉진하여 핵으로 이동한 PTEN 단백질이 종양억제 유전자로서의 기능을 한다는 보고도 동시에 발표되었다. 하지만, NEDD4-1  단백질에 의한 PTEN 단백질의 유비퀴틴화는 NEDD4-1 단백질의 과발현만으로는 촉진되지 않는다는 상반된 연구결과가 보고되었다. 따라서  NEDD4-1에 의한 PTEN 단백질 조절 기전을 명확히 밝히는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다.
  2. 연구내용
 NEDD4-1에 의한 PTEN 단백질 조절을 규명하기 위해 NEDD4-1과 결합하여  PTEN 단백질 분해를 조절하는 새로운 인자를 동정했다.  NEDD4-1이  과발현되어 있는 다양한 3개의 암 세포주와 NEDD4-1 과발현에 의해 PTEN의  단백질 분해가 촉진되지 않는 293세포주 총 4가지 세포주들을 이용하여 NEDD4-1과 결합하는 단백질을 MALDI-TOF 분석 방법을 통해 확인한 결과 “p34SEI-1” 단백질로 밝혀졌다. p34SEI-1 단백질과 NEDD4-1  단백질은 NEDD4-1이 과발현되어 있는 인간 암 세포주 모두에서  결합하였으며, 293 세포주에서는 p34SEI-1 단백질은 존재하지 않는 것으로  확인되었다. p34SEI-1 단백질은 NEDD4-1에 결합하여  NEDD4-1의  자가유비퀴틴화 과정을 억제시켜 NEDD4-1 단백질에 안정화를 야기하였다.  p34SEI-1 단백질의 과발현은 PTEN 단백질의 폴리유비퀴틴화를 촉진하여  단백질을 분해시켰으며, 이러한 현상은 NEDD4-1 단백질 의존적으로  이루어졌다. 또한, NEDD4-1에 의한 PTEN 단백질의 폴리유비퀴틴화 과정은  p34SEI-1 단백질의 존재하에서만 이루어졌다. 즉, p34SEI-1 단백질이  NEDD4-1과 결합하여 단백질의 안정화를 가져와 NEDD4-1과 PTEN  단백질의 결합력을 증가시켜 폴리 유비퀴틴화를 촉진시켜서 PTEN 단백질의  분해를 촉진시키는 것이다.
 p34SEI-1 단백질 존재 유무에 의한 NEDD4-1에 의한 PTEN 단백질의 폴리유비퀴틴화와 모노유비퀴틴과정을 알아보기 위하여 NEDD4-1과  p34SEI-1 단백질이 과발현되어 있는 인간 유방암 MCF-7 세포주에  p34SEI-1 단백질을 siRNA 기법으로 knockdown 시킨 결과 PTEN의  모노유비퀴틴화가 촉진되어 핵으로 이동하는 사실을 관찰하였다.  p34SEI-1 단백질 존재 유무에 의한 종양 생성 유무를 관찰하기 위하여  NEDD4-1과 p34SEI-1 단백질이 과발현 되어 있는 인간 유방암 세포주와  전립선암 세포주에 p34SEI-1 inducible shRNA stable 세포주를 구축하여  인위적으로 p34SEI-1 단백질을 억제시킨 결과 PTEN 단백질이 핵으로  이동하여 종양을 억제시킨다는 사실을 관찰하였다.
 이러한 p34SEI-1, NEDD4-1, PTEN 단백질의 발현 양상은 191명의 인간  대장암 환자에서 p34SEI-1과 NEDD4-1이 함께 발현하고 있는 환자에서는 PTEN 단백질의 발현이 12.8% 로만 발현을 하고 있어 NEDD4-1에 의한 PTEN 단백질의 분해 조절 기전에 p34SEI-1 단백질이 필수적이라는 사실이 증명되었다.            
3. 기대효과
 NEDD4-1에 의한 PTEN 단백질의 분해 조절 기전에 있어서 풀리지 않았던  분자 기전을 p34SEI-1 단백질의 동정으로 인하여 PTEN 단백질의 폴리와 모노유비퀴틴화 과정에 대한 정확한 분자기전을 제시할 수 있게 되었다.
 p53-Hdm2 관계와 같은 정확한 분자 기전을 이해하여 p53 종양 억제 유전자를 재활성화 시키는 약물 개발을 여러 제약회사에서 추진하고 있는 실정에서, p34SEI-1 단백질의 동정은 PTEN 종양 억제 유전자를 재활성화 시키는 맥락에서 항암제 약물 개발에 새로운 타깃으로서 각광을 받을 수 있을 것이다.

연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
PTEN을 조절하는 단백질인 NEDD4-1과 결합하여 PTEN의 모노- 혹은 폴리- 유비퀴틴화 현상에 대한 분자적 기전을 밝히고 모노와 폴리 유비퀴틴화에 대한 새로운 조절인자의 존재를 제시하였다.
어디에 쓸 수 있나
PTEN, NEDD4-1, p34SEI-1 단백질이 존재하는 고형암에서 (예: 대장암, 전립선암, 유방암) p34SEI-1 단백질에 대한 저해제를 개발하여 PTEN 유전자를 활성화시키는 항암제로서 개발을 기대할 수 있다.
실용화까지 필요한 시간은
p34SEI-1과 NEDD4-1 결합 저해제 약물 개발 스크리닝과 전임상 효능 분석을 위하여 최소 1-2년의 개발기간이 필요할 것이다. 이 후에 임상시험 등의 과정이 필요할 것으로 생각된다.
실용화를 위한 과제는
p34SEI-1과 NEDD4-1 결합 저해제 약물에 대한 스크리닝을 위하여 특정 암종 선택과 실제 in vivo model에서 최적의 항암 효능을 위한 농도 선정이 관건으로 생각된다.
연구를 시작한 계기는
단백질 분해 과정을 연구하던 중에, NEDD4-1 단백질이 PTEN 단백질의 선택적인 모노와 폴리 유비퀴틴화에 대한 과정을 조절하는 새로운 인자가 있을 것이라고 생각하여 연구를 시작하였다.
에피소드가 있다면
다양한 암 세포주를 이용하여 어떤 특정 단백질과 결합하는 동일한 MALI-TOFF 분석 결과를 얻는 과정이 힘들었다. 
꼭 이루고 싶은 목표는
p34SEI-1 저해제 약물을 개발하여 p53을 재활성화 시키는 약물뿐만 아니라 PTEN을 재활성화 시켜서 암을 억제하는 약물 개발에 대한 초석이 되었으면 한다.
신진연구자를 위한 한마디
흘린 땀은 거짓말을 하지 않는다. 지금도 어디선가 새벽에 무엇인가를 궁금해 하며 연구를 하고 있는 연구자들은 언젠가 흘린 땀만큼의 결과를 얻을 수 있을 것이다. 
p34SEI-1의 존재여부에 따른 NEDD4-1에 의한 PTEN의 유비퀴틴화 조절
그림 1. p34SEI-1의 존재여부에 따른 NEDD4-1에 의한 PTEN의 유비퀴틴화 조절
a. p34SEI-1이 존재하지 않으면 NEDD4-1에 의하여 PTEN의 모노 유비퀴틴(빨간색 별표)이 일어나며 p34SEI-1이 존재하면 NEDD4-1에 의하여 PTEN 단백질의 폴리 유비퀴틴화(5번 lane: 여러개의 유비퀴틴이 결합하여 위 아래로 끌리는 현상)가 일어남
b. p34SEI-1 단백질을 siRNA 기법으로 억제하면 세포질에 존재하던 (맨 위쪽 왼쪽 패널) PTEN 단백질이 모노 유비퀴틴화가 일어나 핵으로 이동(아래쪽 맨 왼족 패널)함.
대장암 환자 조직 중 p34SEI-1, NEDD4-1이 발현되면서 PTEN이 발현되지 않는 비율을 면역화학염색법을 통해 확인
그림 2. 대장암 환자 조직 중 p34SEI-1, NEDD4-1이 발현되면서 PTEN이 발현되지 않는 비율을 면역화학염색법을 통해 확인.
a. NEDD4-1, p34SEI-1 단백질이 동시 발현되면서 PTEN 단백질 발현을 하지 않는 경우가 총 117명의 환자 조직에서 102명(87.2%)의 환자에서 높게 나타나며 PTEN 발현을 하는 경우는 15명(12.8%)의 환자로 적게 나타남
b. 환자조직에서 p34SEI-1, NEDD4-1 발현이 높고(갈색) PTEN의 발현은 거의 없음.   
p34SEI-1과 NEDD4-1의 상호 조절을 통해 PTEN 종양억제단백질이 poly-유비퀴틴화된다는 모식도
그림 3. p34SEI-1과 NEDD4-1의 상호 조절을 통해 PTEN 종양억제단백질이 poly-유비퀴틴화된다는 모식도. p34SEI-1 단백질이 NEDD4-1과 결합하면 PTEN  단백질의 폴리 유비퀴틴화가 일어나서 세포질에 있는 프로테아좀에 의해 분해가 일어나며, p34SEI-1 단백질이 존재하지 않게 되면 PTEN 단백질의 모노 유비퀴틴화가 일어나서 핵내로 이동하여 종양 억제 유전자로서의 기능을 하게 됨.
Journal reference
Cell Death Differ. 2013 Oct 18. doi: 10.1038/cdd.2013.141.
p34 is a novel regulator of the oncogenic behavior of NEDD4-1 and PTEN.
Hong SW, Moon JH, Kim JS, Shin JS, Jung KA, Lee WK, Jeong SY, Hwang JJ, Lee SJ, Suh YA, Kim I, Nam KY, Han S, Kim JE, Kim KP, Hong YS, Lee JL, Lee WJ, Choi EK, Lee JS, Jin DH, Kim TW.
 
출처 : 한국연구재단 (2013-10-29 10:01)
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